Prehľad

NanoDSF je skratka pre nanoformát diferenčnej skenovacej fluorometrie (DSF). Je to rýchla, robustná, kvalitná a - čo je najdôležitejšie - metóda bez značenia a v roztoku na analýzu stability proteínov, tepelného rozkladu proteínov a analýzy teploty topenia. V dôsledku toho je nanoDSF skvelým nástrojom na skríning pufrov a formulácií, ako aj skríning knižníc zlúčenín s malými molekulami na vplyv na stabilitu proteínov a posuny teploty topenia. Okrem toho nanoDSF umožňuje analyzovať koloidnú stabilitu proteínových roztokov (agregácia).

Všeobecne je vnútorná fluorescencia proteínov tryptofánu silne závislá od ich 3D štruktúry, a teda od miestneho okolia zvyškov tryptofánu. Použitím chemických denaturantov alebo tepelného gradientu sa proteíny môžu rozvinúť, čo vedie k zmenám ich vnútornej fluorescencie tryptofánu. To sa premieta do zmien špičiek fluorescenčných emisií a zmien intenzity. NanoDSF monitoruje tieto zmeny fluorescencie s vysokým časovým rozlíšením a môže odhaliť aj viacnásobné rozvíjajúce sa prechody. NanoDSF je preto vysoko úspešný v oblasti tvorby protilátok, charakterizácie membránových proteínov, kontroly kvality proteínov, skríningu pufrov, analýzy rozloženia proteínov a skríningu väzby na malé molekuly.

Vyššie uvedený obrázok ilustruje princíp rozloženia tepelných bielkovín: Zvyšujúca sa teplota spôsobuje rozvinutie trojrozmernej proteínovej štruktúry, a tak sa zvyšky tryptofánu vystavujú pôsobeniu rozpúšťadla. NanoDSF monitoruje súčasné zmeny fluorescencie tryptofánu pri vlnovej dĺžke 330 a 350 nm.

Na detekciu agregácie proteínov má nanoDSF zariadenie tiež optiku spätného odrazu. Normálne viditeľné svetlo prechádza cez kapiláry obsahujúce vzorku proteínu, ktoré je predmetom záujmu, bez akejkoľvek interferencie, je odrážané zrkadlom na kapilárnom podnose a nakoniec kvantifikované detektorom. Ak vzorka proteínu obsahuje agregované častice, dopadajúce svetlo je rozptýlené týmito časticami. Strata intenzity odrazu je presným meradlom agregácie proteínov.

Technológia

NanoDSF je metóda diferenciálnej skenovacej fluorimetrie, ktorá je schopná analyzovať konformačnú stabilitu a koloidnú stabilitu (správanie pri agregácii) proteínov za rôznych tepelných a chemických podmienok. Konformačná stabilita proteínu je opísaná podľa jeho rozvinutého prechodného bodu Tm (° C), čo je bod, v ktorom sa rozvinie polovica proteínu. Technológia nanoDSF bez obsahu štítkov monitoruje vnútornú fluorescenciu proteínov tryptofánu, ktorá je vysoko citlivá na blízke okolie zvyškov tryptofánu a ktorá sa mení po tepelnom rozklade.

Až 48 kapilár sa naplní 10 ul vzorky proteínu a súčasne sa skenuje pri vlnových dĺžkach 330/350 nm. Teploty topenia sa zaznamenávajú monitorovaním zmien vnútornej fluorescencie tryptofánu a začiatočné teploty agregácie sa zisťujú pomocou rozptylu svetla so spätným odrazom. Vzorky sa môžu zahriať na akúkoľvek teplotu v rozmedzí od 15 ° C do 95 ° C. Dôležité je, že vzorky sa môžu študovať bez použitia farbiva a s voľným výberom pufra a detergentu. Je možné analyzovať teploty topenia proteínov s koncentráciou medzi 5 ug / ml a 250 mg / ml. Na dosiahnutie vysokej kvality počiatočných teplôt agregácie sú potrebné proteínové roztoky s koncentráciami nad 1 mg / ml.

 

Typické aplikácie

Vďaka robustnej metóde detekcie a rýchlemu tempu analýzy je nanoDSF veľmi univerzálny a dá sa použiť v mnohých kontextoch:

• Skríning pufrov, formulácií a tlmivých prísad

• Skríning čistiacich prostriedkov

• Analýza tepelného a chemického rozkladu bielkovín

• Dlhodobá optimalizácia ukladania proteínov a protilátok

• Testovanie stability s nútenou degradáciou

• Porovnanie biologicky podobných proteínov a protilátok s ohľadom na stabilitu a agregáciu

• Porovnávacie testy medzi šaržami

• Analýza hlbokých znakov (vplyv mutácií, modifikácií, konjugácií na stabilitu a agregáciu proteínov)

Výhody

• nanoDSF nevyžaduje fluorescenčné farbivá ako Sypro Orange ako v štandardnom DSF (thermofluor)

• Nízka spotreba vzorky → Vyžaduje sa iba 10 µl vzorky

• Voľný výber testovacích tlmivých roztokov → prísad / detergentov

• Veľmi krátky čas analýzy → umožňuje vysoký výkon

• Optimálna kvalita a rozlíšenie údajov → Dual 350/330 nm UV-detekcia

• Široký teplotný rozsah → možná analýza od 15 ° C do 95 ° C

• Nevyžaduje sa označenie → Je možná analýza podobná pôvodnému údajom

• Široký rozsah koncentrácií → 5 µg / ml až 200 mg / ml

• Široký rozsah veľkosti molekúl → Od 1 kDa do 1 MDa