Základný výskum
Určenie štruktúry N-terminálnej časti ľudského ryanodínového receptora 2

Autori: Ľ. Borko, V. Bauerová-Hlinková, E. Hostinová, J. Gašperík, A. Zahradníková, J. Ševčík

V našom laboratóriu sme difrakčnými metódami a SAXS analýzou určili terciárnu štruktúru N-konca ľudského ryanodínového receptora 2 (hRyR2; ak. 1-606). Fragment RyR2_1-606 pozostáva z troch domén stabilizovaných unikátnou sieťou interakcií. Určenie terciárnej štruktúry umožnilo lepšie porozumieť mechanizmom, ktorými RyR2 mutácie spôsobujú závažné srdcové ochorenia.

Projekty:

1.   APVV-0628-10 - Štruktúrne a funkčné aspekty regulácie ľudského ryanodínového receptora a jej narušení mutáciami

2.   MVTS 1520  - Integrovaná infraštruktúra pre štruktúrnu biológiu

Publikácie:

1.   Borko Ľ, Bauerová-Hlinková V, Hostinová E, Gašperík J, Beck K, Lai FA, Zahradníková A, Ševčík J (2014) Structural insights into the human RyR2 N-terminal region involved in cardiac arrhythmias. Acta Cryst D 70, 2897-2912.

Základný výskum
Asociácia fosforyláciou regulovaného kalpainového štiepneho miesta v C-terminálnom konci GlyT1 s väzobným miestom pre kalmodulín

Autori: A. Miháliková, M. Baliová, F. Jurský

Cytoplazmatické úseky transportérov neurotransmiterov hrajú dôležitú úlohu v procese ich správneho umiestnenia v cytoplazmatickej membráne. Aj keď je známe, že tento proces je regulovaný vápnikom, konkrétne proteíny a mechanizmus sú z veľkej časti neznáme. V našej práci sa nám podarilo dokázať, že C-terminálny koniec glycínového transportéra GlyT1 obsahuje doteraz neidentifikované väzbové miesto pre vápnik viažúci proteín kalmodulín. Priebeh interakcie má sigmoidálny charakter, čo naznačuje možnú spínaciu funkciu. Kalmodulín viažúce miesto je lokalizované v blízkosti štiepneho miesta vápnikovo závislej proteázy kalpain, ktoré je ako sme ukázali v ďalšom článku regulované fosforyláciou. Kalmodulínove aj kalpainové miesto sa prekrývajú so sekvenciami ktorých mutácie blokujú exit GlyT1 z endoplazmatického retikula. Je preto pravdepodobné, že nami identifikované interakcie zohrávajú úlohu v tomto procese a predstavujú príspevok k poznaniu identity proteínov regulujúcich putovanie transportérov neurotransmiterov do membrány.

Projekty:

1. VEGA 2/0084/13-Inhibícia transportérov neurotransmiterov benzofenantridínovými alkaloidmi.

Publikácie:

1. Mihalikova, A., Baliova, M., Jursky (2014) Calcium Dependent Interaction of Calmodulin with the GlyT1 C-terminus. Neurochem. Res. 39: 2225–2233.

2. Mihalikova, A., Baliova, M., Jursky, F. (2014) Effect of phosphomimetic mutations on the C-terminal sensitivity of glycine transporter GlyT1 to calpain. Neuroscience Research 81–82: 85–91.

Základný výskum
Charakterizácia regulácie dvoch stresových sigma faktorov SigH a SigF fosforylačným mechanizmom prostredníctvom pleiotropického anti-anti-sigma faktora BldG u Streptomyces coelicolor A3(2)

Autori: J. Kormanec, B. Ševčíková, R. Nováková, D. Homerová, B. Řežuchová, Ľ. E. Mingyar

Na rozdiel od iných baktérií, pôdna baktéria Streptomyces coelicolor obsahuje až 9 homológov stresového sigma faktora SigB, 60 homológov anti-sigma faktora RsbW, 18 homológov anti-anti-sigma faktora RsbV, čo súvisí s jej komplexným životným cyklom a miestom jej výskytu, kde je vystavená plejáde stresových signálov. Jeden z anti-anti-sigma faktorov, BldG, hrá dôležitú úlohu v morfologickej diferenciácii, ako aj v produkcii antibiotík u S. coelicolor a aktivuje stresový sigma faktor SigH po osmotickom strese a počas diferenciácie prostredníctvom interakcie s anti-sigma faktorom UshX. Avšak UshX nebol schopný in vitro fosforylovať BldG. Preto musí existovať iná proteín-kináza medzi 60-timi homológmi anti-sigma faktora RsbW schopná špecificky fosforylovať BldG. Kombináciou viacerých prístupov sme identifikovali ďalší anti-sigma faktor, RsfA, špecificky interagujúci a fosforylujúci BldG. Avšak RsfA je rovnako špecifický anti-sigma faktor pre ďalší z deviatich sigma faktorov, SigF, ktorý hrá dôležitú úlohu v neskorých štádiách diferenciácie. Charakterizovali sme aj transkripciu génu rsfA. Je riadená jediným promótorom, ktorého aktivita bola reprimovaná počas osmotického stresu a v neskorých štádiách diferenciácie, teda podmienok aktivácia SigH. Tieto výsledky naznačili výnimočný jav, kedy pleiotropický anti-anti-sigma faktor BldG hrá úlohu v aktivácii minimálne dvoch sigma faktorov SigH a SigF u S. coelicolor A3(2).

Projekty:

1. VEGA 2/0028/12 – Komplexná regulácia odozvy na stres, bunkovej diferenciácie a patogenicity u baktérií prostredníctvom sigma faktorov RNA polymerázy a regulátorov ich aktivity.

Publikácie:

1. Mingyar, E., Sevcikova, B., Rezuchova, B., Homerova, D., Novakova, R., Kormanec, J. (2014) The δ^F-specific anti-sigma factor RsfA is one of the protein kinases that phosphorylates the pleiotropic anti-anti-sigma factor BldG in Streptomyces coelicolor A3(2). Gene 538: 280-287.

Aplikovaný výskum
Rozšírenie vedeckých poznatkov o kvalite a bezpečnosti Slovenskej bryndze modernými mikrobiologickými, molekulárno-biologickými a chromatografickými metódami.

Autori: A. Puškárová, L. Kraková, M. Bučková, D. Pangallo

Výsledkom riešenia projektu bolo získanie nových poznatkov o mikroflóre bryndze a profile prchavých aromaticky aktívnych látok v dynamickej dimenzii a na geograficky reprezentatívnej úrovni. S použitím kombinácie kultivačných a nekultivačných mikrobiologických resp. molekulárno-biologických postupov, a s použitím plynovej chromatografie - olfaktometrie s podporou plynovej chromatografie - hmotnostnej spektrometrie, sa študovala májová bryndza (ako vymedzený typ letnej bryndze) a sudovaný ovčí syr (ako určujúci medziprodukt vo výrobe zimnej bryndze). Charakterizovala sa prokaryotická i eukaryotická mikrobiálna diverzita (najmä laktokoky, laktobacily a Galactomyces/Geotrichum) a profily prchavých aromaticky aktívnych látok počas výroby májovej bryndze (27 látok). Na základe analýzy vzoriek zo 7 výrobní z rôznych oblastí SR sa preukázala vysoká miera homogenity charakteristík májovej bryndze, čo je dobrým podkladom pre jej objektívnu definíciu z hľadiska štatútu PGI. Zistili sme vymiznutie viacerých prchavých aróma-aktívnych látok pri spracovaní vyzretého ovčieho hrudkového syra na májovú bryndzu, čo môže vysvetľovať zlepšené organoleptické vlastnosti a subjektívnu akceptovateľnosť májovej bryndze. Mikrobiálna diverzita (najmä laktokoky, laktobacily a Galactomyces/Geotrichum) a profily prchavých aromaticky aktívnych látok (39 látok) sa stanovili tiež pre sudovaný ovčí syr. Keďže až 25 látok sa zistilo výlučne v sudovanom ovčom syre a nie v májovej bryndzi, usudzujeme, že zlúčená definícia „Slovenskej bryndze", ktorá zahŕňa aj májovú/letnú bryndzu a aj zimnú bryndzu, je vedecky neoprávnená. Výrazné rozdiely v profile prchavých aromaticky aktívnych látok sme zistili tiež medzi bryndzou z tradičných výrob a jej (polo)priemyselnými analógmi.

Projekty:

1. APVV-0590-10 - Rozšírenie vedeckých poznatkov o kvalite a bezpečnosti Slovenskej bryndze modernými mikrobiologickými, molekulárno-biologickými a chromatografickými metódami.

Publikácie:

1. Pangallo, D., Šaková, N., Koreňová, J., Puškárová, A., Kraková, L., Valík, L., & Kuchta, T. (2014) Microbial diversity and dynamics during the production of May bryndza cheese. International journal of food microbiology. 170: 38-43.

2. Sádecká, J., Kolek, E., Pangallo, D., Valík, L., & Kuchta, T. (2014) Principal volatile odorants and dynamics of their formation during the production of May Bryndza cheese. Food chemistry. 150: 301-306.

Medzinárodné vedecké projekty
Štruktúra a funkcia metyltransferázy z Streptomyces caelestis

Autori: J. Bauer, G. Ondrovičová, V. Pevala , E. Kutejová

SAM-závislá metyltrasferáza CcbJ zo Streptomyces caelestis katalyzuje jeden z posledných krokov biosyntézy antibiotika celesticetínu, a to metyláciu atómu dusíka na propylprolínovej časti, čo má za následok výrazné zvýšenie jeho aktivity. Bola určená jeho štruktúra a štruktúra jeho komplexu so SAH. Na základe týchto štruktúr bola CcbJ priradená k SAM-závislým metyltrasferázam triedy I. Táto metyltrasferáza má aktívne miesto, ktoré dokáže prijať pomerne širokú škálu substrátov. Mechanizmus účinku CcbJ bol charakterizovaný štúdiom rôznych mutantov a dokovaním.

Projekty:

1. VEGA 2/0122/11 - Proteínové komplexy mitochondriálneho nukleoidu

2. MVTS 1520 - Integrovaná infraštruktúra pre štruktúrnu biológiu

Publikácie:
1. Bauer, J., Ondrovicova, G., Najmanova, L., Pevala, V., Kamenik, Z., Kostan, J., Janata, J., Kutejova, E. (2014) Structure and possible mechanism of the CcbJ methyltransferase from Streptomyces caelestis. Acta Crystallogr. D. 70(4): 943-957.

Medzinárodné vedecké projekty
Neskorý endozomálny transportér CD222 riadi priestorovú distribúciu a aktivitu kinázy Lck

Autori: G. Ondrovičová, V. Leksa

Pre správny chod imunitného systému je dôležité, aby bola aktivácia T buniek cez T bunkový receptor správne vyvážená. Kľúčovú úlohu pri tom zohráva kináza Lck, ktorá je pri aktivácii T buniek premiestnená k T bunkovému receptoru, kde svojou fosforylačnou aktivitou spúšťa signalizačnú kaskádu. V našej práci sme ukázali, že pre aktiváciu T buniek je nevyhnutný receptor pre manóza 6-fosfát (CD222), ktorý prenáša Lck k plazmatickej membráne T buniek. Tento objav sme učinili prostredníctvom mnohých metodík vrátane biochemických techník, ako je imunoprecipitácia či hmotnostná spektrometria, konfokálnej mikroskopie, ale aj bunkových meraní s použitím geneticky upravených T buniek. Práca môže mať význam pre farmakologické modelovanie funkcie T buniek.

Projekty:

1. VEGA 2/0063/14 - Proteolytický systém na povrchu buniek v apoptóze ako súčasť protizápalového mikroprostredia

2. FWF - Austrian Science Fund No. P22908 - The Integral Regulatory Role of (CD222) in T cell activation.

Publikácie:

1. The Late Endosomal Transporter CD222 Directs the Spatial Distribution and Activity of Lck. Pfisterer K, Forster F, Paster W, Supper V, Ohradanova-Repic A, Eckerstorfer P, Zwirzitz A, Donner C, Boulegue C, Schiller HB, Ondrovicova G , Acuto O, Stockinger H, Leksa V. (2014) J Immunol. 193(6): 2718-32.

Medzinárodné vedecké projekty
Zavedenie nových spektroskopických a elektrón-mikroskopických metód na určenie obsahu jednotlivých prvkov a látok v bakteriálnych spórach

Autori: I. Barák, J. Jamroškovič

Bakteriálne spóry sú nesmierne rezistentné k účinkom rôznych enviromentálnych podmienok ako vysoká teplota, sucho a chemické oxidačné činidlá. Spóry sú obalené niekoľkými vrstvami proteínov a peptidoglykánu, ktoré obaľujú stred bunky s DNA s veľkým obsahom vápnika a dipikolíniovej kyseliny (DPA). V rámci tohto projektu sa nám podarilo zaviesť nové spektroskopické a elektrón mikroskopické metódy na štúdium obsahu rôznych prvkov a (DPA) v spórach Bacillov a Clostrídií.

Projekty:

1. Scopes – Swiss National Foundation (IZ73Z0_152527 / 1) - Úloha homeostázie kovov, ich redukcia a sporulácia v rezistencii Gram-pozitívnych baktériách.

Publikácie:

1. Jamroskovic J., Shao P.P., Suvorova E., Barak I., Bernier-Latmani R. (2014) Combined scanning transmission X-ray and electron microscopy for the characterization of bacterial endospores. FEMS Microbiol. Lett. 358: 188-193.