Základný výskum
In silico charakterizácia enzýmových špecificít v alfa-amylázovej rodine GH57 a jej evolučná príbuznosť s rodinou GH119

Autori: Š. Janeček, K. Blesák, A. Kuchtová

Rodina glykozidových hydroláz GH57, známa tiež ako druhá, menšia alfa-amylázová rodina, obsahuje päť enzýmových špecificít: alfa-amylázu, amylopululanázu, glukán-vetviaci enzým, 4-alfa-glukanotransferázu a alfa-galaktozidázu. Tieto enzýmy ako katalytickú doménu adoptujú štruktúru tzv. nekompletného TIM-barelu s katalytickými zvyškami glutamátom (katalytický nukleofil) a aspartátom (donor protónu) v konzervovanom sekvenčnom regióne 3, resp. 4. Podstatná časť z takmer 900 sekvenovaných členov rodiny GH57 je produkovaná termofilnými prokaryotmi, pričom iba menej ako 20 enzýmov bolo doteraz biochemicky charakterizovaných. Na základe bioinformatickej analýzy 367 GH57 sekvencií - 56 bolo ohodnotených ako alfa-amylázy, 99 ako amylopululanázy, 158 ako glukán-vetviace enzýmy, 46 ako 4-alfa-glukanotransferázy a 8 ako alfa-galaktozidázy - bolo pre každú špecificitu vytvorené sekvenčné logo, v rámci ktorého boli identifikované jej unikátne sekvenčné črty. Tieto sekvenčné črty boli navrhnuté ako tzv. „odtlačky prstov“ pre jednotlivé enzýmové špecificity z rodiny GH57. Výsledky tejto štúdie môžu nájsť uplatnenie v proteínovom dizajne amylolytických enzýmov z tejto rodiny, ako aj pri prisudzovaní špecificity pre hypotetické proteíny GH57 pred ich biochemickou charakterizáciou. Rodina glykozidových hydroláz GH119 môže byť považovaná za zatiaľ poslednú, tretiu a najmenšiu alfa-amylázovú rodinu (iba 6 sekvenovaných členov, z toho jeden proteín charakterizovaný ako alfa-amyláza). Ani terciárna štruktúra, ani katalytické zvyšky žiadneho zástupcu rodiny GH119 neboli doteraz známe. Na základe detailnej in silico analýzy, ktorá zahŕňala porovnanie aminokyselinových sekvencií v kombinácii s nástrojom BLAST a serverov pre modelovanie terciárnej štruktúry, bola odhalená príbuznosť medzi rodinami GH57 a GH119. Pre rodinu GH119 bola takto predpovedaná štruktúra nekompletného TIM-barelu ako jej katalytická doména s odpovedajúcou dvojicou katalytických zvyškov: glutamát (katalytický nukleofil) a aspartát (protón donor) v konzervovanom sekvenčnom regióne 3, resp. 4; analogicky s rodinou GH57.

Projekty:

1. VEGA 2/0148/11 - Bioinformatické štúdium amyláz ako základ pre ich proteínový dizajn.

2. LPP-0417-09 - Bioinformatická analýza amyláz.

Publikácie:

1. Blesak, K., Janecek, S. (2012) Sequence fingerprints of enzyme specificities from the glycoside hydrolase family GH57. Extremophiles. 16: 497-506.

2. Janecek, S., Kuchtova, A. (2012) In silico identification of catalytic residues and domain fold of the family GH119 sharing the catalytic machinery with the alpha-amylase family GH57. FEBS Letters. 586: 3360-3366.

Základný výskum
Molekulárny mechanizmus účinku alkaloidu sanginarín na glycínový transportér GlyT1

Autori: F. Jurský, M. Baliová, D., A. Miháliková

Sanginarín je prírodný alkaloid vyskytujúci sa spolu s ďalšími alkaloidmi niekedy až v milimolárnej koncentrácii v špecializovaných, tzv. latexových vezikulách niektorých rastlín. Pre rôznorodé biologické účinky alkaloidov ľudstvo už odpradávna používa extrakty týchto rastlín ako súčasť tradičných prírodných medicín. Aj keď dominantné mechanizmy účinku viacerých alkaloidov na ľudský organizmus boli už identifikované, predpokladá sa, že mnohé cieľové molekuly alkaloidov zostávajú doteraz neznáme, čo znemožnuje naplno využiť ich farmaceutický potenciál. V našej práci sa nám podarilo identifikovať glycínový transportér GlyT1 ako jednu z doteraz neznámych cieľových molekúl alkaloidu sanginarín. Na základe molekulového modelovania, citlivosti sanginarínu k sulfozlúčeninám a jeho pH závislej tautomérie sme zistili, že sanginarín najskôr vo forme membránami prenikajúcej pseudoformy vnikne do bunky, následne atakuje jeden z cysteínov  glycínového transportéra GlyT1, čím  ireverzibilne tento transportér inaktivuje. Kedže nami získané výsledky definujú aj konkrétne miesto účinku sanginarínu na molekule GlyT1, mohli by poslúžiť ako základ pre testovanie modifikovaných analógov sanginarínu a získaniu série nových typov inhibítorov transportéra GlyT1. Tento transportér predstavuje farmakologicky zaujímavú molekulu hlavne z hľadiska regulácie prenosu signálov bolesti a fungovania vyššej nervovej činnosti.

Projekty:

1. VEGA 2/0045/10 - Proteolytická modifikácia transportérov glycínu počas programovanej bunkovej smrti.

2. VEGA 2/0045/10 - Interakcie GABA transportéra GAT1 s cytosolickými regulačnými proteínmi.

Publikácie:

Jursky, F., Baliova, M., Mihalikova, A. (2012) Molecular basis for differential glycine transporters sensitivity to sanguinarine. Toxicol Lett. 212: 262-267

Základný výskum
Identifikácia domény s primázovou a polymerázovou aktivitou na multifunkčnom proteíne gp43 korynefága BFK20

Autori: G. Bukovská, N. Halgašová, I. Mesarosová

Korynefág BFK20 je prvým korynefágom s kompletne osekvenovaným a anotovaným genómom. Bioinformatickou analýzou bol identifikovaný klaster skorých génov kódujúcich replikačné proteíny. Jedným z týchto replikačných proteínov je multifunkčný proteín gp43 podobný RepA proteínom z rôznych plazmidov. C-koncová časť proteínu gp43 je podobná helikázam z rodiny SF4, o N-koncovej časti sme sa domnievali, že by mohla fungovať ako primáza. Sekvenčná analýza tejto oblasti odhalila prítomnosť prim-pol domény, ktorá sa vyskytuje v proteínoch kódovaných na niektorých archeálnych plazmidoch. Bifunkčné primázy-polymerázy nesú primázovú aj polymerázovú aktivitu v rámci jedného proteínu a za obe aktivity zodpovedajú rovnaké konzervované aminokyseliny v aktívnom mieste enzýmu. V našej práci sme sa zamerali na dokázanie primázovej aj polymerázovej aktivity v N-koncovej doméne proteínu gp43. Klonovali sme časť génu ORF43 a  372 aminokyselín z N-konca proteínu gp43 s predpokladanou prim-pol doménou sme exprimovali ako proteín gp43N. Rekombinantný proteín gp43N sme izolovali a charakterizovali. Použili sme viaceré metódy na dôkaz jeho primázovej a polymerázovej aktivity. Zaviedli sme metódu založenú na kvantifikácii pyrofosfátu produkovaného pri primázovej a polymerázovej reakcii. Uvoľnený pyrofosfát sme štiepili pyrofosfatázou na fosfát a tento sme stanovili pomocou kolorimetrickej reakcie s malachit-molybdénanovým komplexom. Ako ďalšie sme použili elektroforetické metódy, elektroforézu v agarózovom géli na monitorovanie polymerázovej aktivity a elektroforézu v polyakrylamidovom géli na potvrdenie primázovej aktivity. Zistili sme, že pri syntéze primerov využíval proteín gp43N deoxyribonukleotidy, v prítomnosti iba ribonukleotidov v reakčnej zmesi k syntéze primerov nedochádzalo. Táto vlastnosť je charakteristická skôr pre archeálne primázy eukaryotického typu. Prim-pol doména proteínu gp43 korynefága BFK20 patrí k novej skupine archeo-eukaryotických primáz-polymeráz a je prvou takouto exprimovanou, izolovanou a charakterizovanou doménou pochádzajúcou z bakteriofága.

Projekty:

1. VEGA 2/0110/11 - Štúdium replikačného modulu korynefága BFK20.

Publikácie:

1. Halgasova, N., Mesarosova, I., Bukovska, G. (2012) Identification of a bifunctional primase-polymerase domain of corynephage BFK20 replication protein gp43. Virus Research. 163: 454-460.

Aplikovaný výskum
Analýza mikroflóry slovenskej bryndze a vínnych vzoriek prostredníctvom aplikácie kultivačne závislých a nezávislých prístupov

Autori: D. Pangallo, L. Kraková, K. Chovanová

Mikroflóra baktérií a húb bryndze bola identifikovaná PCR metódami orientovanými na ITS oblasť medzi 16S a 23S rDNA (pre baktérie) a 5,8S a 26S rDNA (pre huby). Tento nekultivačný prístup bol testovaný na vybraných vzorkách bryndze. Okrem rozšírenia informácií o mikroflóre slovenskej bryndze získaných kultivačne nezávislými metódami, naša štúdia tiež zavádza nové metódy vhodné pre analýzy baktérií a húb v syroch. Štúdia ponúka kombináciu univerzálneho reverzného primeru orientovaného na 23S rDNA, ktorá je vhodnejšia na amplifikáciu 16S – 23S medzigénového úseku baktérií mliečneho kvasenia. Metóda automatizovanej analýzy ribozomálnych medzigénových úsekov (automated ribosomal intergenic spacer analysis ARISA) opisovaná v našej štúdii bola optimalizovaná a ukázala sa byť vhodnou pre efektívne analýzy druhov baktérií a húb v syroch. Veríme, že metóda má potenciál byť efektívne aplikovanou tiež pre mikrobiálne komunity v iných druhoch potravinový ch produktov.
Prieskum mikroflóry kvasiniek počas fermentácie muštu dvoch vínnych odrôd (Frankovka modrá – Blaufrankisch a Veltlínske zelené – Gruner Veltliner) z dvoch následných ročníkov bola uskutočnená použitím trojkrokového prístupu. Stratégia prieskumu pozostávala z kombinácie kultivácie kvasiniek, selekcie izolovaných kvasiniek na základe amplifikácie úseku ITS2 použitím fluorescenčne značeného primeru (f-ITS PCR) a nakoniec identifikácie založenej na sekvenovaní úseku ITS1-5.8S rDNA-ITS2 selektovaných kvasiniek. Toto je jedna z mála štúdií zameraných na diverzitu kvasiniek slovenských vín a v dvoch odrodách kultivovaných vo veľkej miere v strednej Európe. Trojkrokový prístup umožnil rýchlu a hodnovernú identifikáciu izolovaných kvasiniek. Fluorescenčná ITS PCR so svojou diskriminačnou silou môže byť vhodným molekulárnym nástrojom na selekciu kvasiniek získaných z potravín a iného prostredia.

Projekty:

1. APVV-0219-07 - Molekulárno-biologická charakterizácia spoločenstiev kvasiniek vo výrobe typických slovenských vín.

Publikácie:

1. Chebenova, V., Zenisova, K., Kuchta, T., Pangallo, D., Brezna, B. (2011) Culture-independent detection of microorganisms in traditional Slovakian bryndza cheese. Int. J. Food Microbiol. 150(1): 73-78.

2. Chovanova, K., Krakova, L., Zenisova, K., Chebenova, V., Brezna, B., Kuchta, T., Pangallo, D. (2011). Selection and identification of autochthonous yeasts in Slovakian wine samples using a rapid and reliable three-step approach. Lett. Appl. Microbiol. 53(2): 231-237.

Medzinárodné vedecké projekty
Detailná charakterizácia komplexov receptora pre manózu 6-fosfát, ktoré kontrolujú aktiváciu a internalizáciu plazminogénu v bunkách

Autori: V. Leksa, G .Ondrovičová, V. Pevala, E. Kutejová

Proteolytická kaskáda na povrchu buniek ústiaca do aktivácie plazminogénu urokinázou na serínovú proteázu plazmín je jedným z centrálnych systémov, ktoré bunky využívajú na svoj pohyb cez tkanivá. V minulosti sme ukázali, že receptor pre manózu 6-fosfát (CD222) kontroluje túto kaskádu reguláciou receptoru pre urokinázu (CD87) a priamou väzbou na plazminogén (Schiler 2009 a Leksa 2011). V našej najnovšej práci (Leksa 2012) sme ukázali, že CD222 sprostredkúva aj internalizáciu plazminogénu, čo vedie k jeho degradácii a okrem toho sme identifikovali agonistický peptid odvodený z CD222, ktorý túto internalizáciu podnecuje. Tento mechanizmus môže byť dôležitý pre obmedzenie proteolytickej aktivity v čase a priestore, to jest na špecifické substráty v určitom čase.

Projekty:

1. Austrian Science Fund Grants P19014-B13, P22908, and I00300

2. PVT-51-026204

3. VEGA 2/5119/25

4. Bilateral Cooperation Slovakia-Austria SK-11-AUT-9

Publikácie:

1. Leksa, V., Pfisterer. K., Ondrovičová, G., Binder, B., Lakatošová, S., Donner, C., Schiller, HB., Zwirzitz, A., Mrvová, K., Pevala, V., Kutejová, E., Stockinger, H. (2012) Dissecting mannose 6-phosphate-insulin-like growth factor 2 receptor complexes that control activation and uptake of plasminogen in cells. J. Biol. Chem. 287: 22450-22462.

Medzinárodné vedecké projekty
Štúdium samoagreagujúcich vlastností morfogenetických proteínov spórového obalu Bacillus subtilis

Autori: D. Krajčíková, I. Barák

Pri formovaní proteínového spórového obalu Bacillus subtilis, vyznačujúceho sa unikátnou odolnosťou voči rôznym fyzikálnym a chemickým vplyvom, hrá kľúčovú úlohu skupina morfogenetických proteínov. Tieto kontrolujú ukladanie takmer 70 proteínov na povrchu spóry v presnom časovom a priestorovom usporiadaní. Pomocou rôznych biochemických, biofyzikálnych a genetických metód sme zistili, že morfogenetické proteíny sú vo vzájomnom kontakte. SpoIVA a SpoVID sú proteíny, ktoré sú zodpovedné za uchytenie spórového obalu na vonkajšej membráne. Kým SpoIVA je dôležité pri prvotnej lokalizácii jednotlivých obalových proteínov na povrchu spóry, SpoVID hrá úlohu neskôr pri vytváraní súvislej vrstvy proteínov okolo spóry. Zistili sme, že SpoIVA a SpoVID interagujú a pomocou techniky AFM (atomic force microscopy) sme charakterizovali dynamiku ich vzájomného kontaktu. Súčasne sme študovali interakciu oboch proteínov s ďalším morfogenetickým proteínom SafA, ktorý kontroluje formovanie vnútornej vrstvy spórového obalu. Kým jeho kontakt so SpoVID bol už známy, vytváranie komplexu so SpoIVA sme objavili a potvrdili pomocou rôznych metód. Paletu priamych kontaktov medzi morfogenetickými proteínmi uzatvára dvojica SpoVID a CotE. CotE, ktorý riadi tvorbu vonkajšej časti spórového obalu, bol v minulosti lokalizovaný na rozhraní vnútornej a vonkajšej časti plášťa a teda jeho kontakt so SpoVID, u ktorého sa predpokladala väzba priamo na vonkajšiu spórovú membránu, sa neočakával. Túto interakciu sme objavili a študovali podrobne použitím viacerých metód. Všetky naše výsledky naznačujú, že morfogenetické proteíny vytvárajú základnú konštrukciu spórového obalu, na ktorú sa postupne prikladajú ostatné obalové proteíny. Súčasne sme pozorovali, že obalové proteíny majú výraznú schopnosť sa samo-usporiadať do veľmi komplexných, ale pravidelných štruktúr, ktoré môžu mať značný potenciál pre vývoj nových nano biomateriálov.

Projekty:

1. VEGA 2/0063/10 - Štúdium tvorby spórového obalu Bacillus subtilis a samoagregujúcich vlastností jeho komponentov.

Publikácie:

1. Qiao H, Krajcikova D, Liu C, Li Y, Wang H, Barak I, Tang J. (2012) The interactions of spore-coat morphogenetic proteins studied by single-molecule recognition force spectroscopy. Chem Asian J. 7(4):725-731.

2. Qiao H, Krajcikova D, Xing C, Lu B, Hao J, Ke X, Wang H, Barak I, Tang J. (2012) Study of the interactions between the key spore coat morphogenetic proteins CotE and SpoVID. J Struct Biol. pii: S1047-8477(12)00314-0.